Som de fleste tenåringer prøver Peter å finne ut hvem han er og hvordan han ble den personen han er i dag. Peter må også forsøke seg frem i sin første ungdomsforelskelse med Gwen Stacy (Stone), og sammen strir de med kjærlighet, forpliktelser og hemmeligheter. Da Peter oppdager en mystisk dokumentmappe som tilhørte faren, begynner en jakt for å forstå foreldrenes forsvinning, noe som fører ham direkte til Oscorp og laboratoriet til dr. Curt Connors (Ifans), farens tidligere samarbeidspartner. Da Spider-Man er på kollisjonskurs med Connors' alter ego, The Lizard, må Peter foreta livsviktige valg om å ta i bruk sine krefter og forme sin skjebne for å bli en helt.
